鈣是影響多種細(xì)胞過程的重要信使，包括細(xì)胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應(yīng)的能力。由于其在細(xì)胞功能中的重要性，細(xì)胞內(nèi)的鈣（稱為細(xì)胞內(nèi)鈣）受到高度調(diào)節(jié)。鈣主要儲(chǔ)存在細(xì)胞器內(nèi)，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，并根據(jù)特定信號(hào)釋放。這種緊密的調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)鈣成為了解細(xì)胞功能和信號(hào)動(dòng)力學(xué)的**工具。

鈣：細(xì)胞過程的多功能指示劑

有幾種細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光指示劑可用于研究細(xì)胞功能。這些指標(biāo)使研究人員能夠檢查傷口**、傳染病、****等過程中的細(xì)胞反應(yīng)。

在我們的實(shí)驗(yàn)室中，我們使用鈣信號(hào)作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號(hào)反應(yīng)的能力，并剖析所涉及的信號(hào)通路。為此，我們利用含有熒光鈣指示劑的細(xì)胞的活細(xì)胞成像，其中熒光的增加表明細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細(xì)胞(MA104)的活細(xì)胞成像。MA104 細(xì)胞，以綠色顯示，表達(dá)鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在這個(gè)活體細(xì)胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細(xì)胞呈紅色——Hyser實(shí)驗(yàn)室此前曾報(bào)道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會(huì)導(dǎo)致受感染細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣增加，隨后激活鄰近細(xì)胞中的特定信號(hào)通路，從而引起未感染細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的增加(Chang-Graham et al., 2020)。

鈣指示劑的種類及其應(yīng)用

鈣指示劑主要分為兩大類：化學(xué)指示劑（即染料）和基因編碼的鈣指示劑（即鈣指示劑被編碼到細(xì)胞系、動(dòng)物模型或系統(tǒng)中）。鈣指示劑已用于使用顯微鏡、高通量篩選和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行體內(nèi)和體外工作。因而，在此我們將關(guān)注使用顯微鏡在體外可視化和量化鈣信號(hào)。用于活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細(xì)胞系、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素。

1.預(yù)期細(xì)胞系：

對于原代細(xì)胞系，直接的方法是使用熒光染料（化學(xué)指示劑），將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，并在孵育期后成像。這些染料也是**實(shí)驗(yàn)收集初步數(shù)據(jù)的**方法。使用熒光染料時(shí)的一個(gè)重要提示是在添加之前和之后徹底清洗細(xì)胞，因?yàn)槿玖蠒?huì)導(dǎo)致高背景熒光，使得在顯微鏡和活體成像期間更難以正確聚焦細(xì)胞。

與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。然而，染料的特異性通常不如遺傳傳感器，并且可能具有更高的背景熒光。在活細(xì)胞成像中，熒光染料（包括Fura-2AM、Fluo-4AM、Indo 1AM等）可以有效地進(jìn)行短期活細(xì)胞成像。一個(gè)潛在的告誡是，在某些細(xì)胞中，細(xì)胞可能會(huì)保留染料或無法正確加載到某些細(xì)胞類型或亞群中。此外，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞有排出染料的趨勢。雖然添加陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑可以防止細(xì)胞排出染料，但這些抑制劑可能對某些細(xì)胞類型可能具有細(xì)胞毒性，如果使用其他**方法評估鈣信號(hào)的變化，可能會(huì)使情況復(fù)雜化。鈣染料的一個(gè)重要考慮因素是使用抑制劑還是激動(dòng)劑。抑制劑和激動(dòng)劑也可能影響鈣染料反映，類似于在天然組織中的表達(dá)。

在廣泛的鈣信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，已建立的細(xì)胞系（包括類器官）可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。遺傳編碼的鎂指示劑被整合到宿主基因組中，允許細(xì)胞正常運(yùn)作，同時(shí)還包括一個(gè)基于熒光蛋白的指標(biāo)，該指標(biāo)將短暫表達(dá)并反映細(xì)胞間鈣信號(hào)的變化。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn)，使指示劑更亮，光穩(wěn)定性更好，動(dòng)態(tài)范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞系中使用的一種**的工具，它將允許您選擇的指示劑在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。基因編碼報(bào)告系統(tǒng)的一個(gè)潛在問題是，并非所有細(xì)胞系都容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在用ADP 進(jìn)行激動(dòng)劑**期間，人腸道類器官單層的實(shí)時(shí)、短期成像。這些有機(jī)體單層以綠色表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動(dòng)劑，用于在細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)。激動(dòng)劑**是測試**劑量反應(yīng)的極好方法。

2.成像長度

時(shí)機(jī)就是一切。對于活細(xì)胞成像，時(shí)間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù)。成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性。應(yīng)避免持續(xù)使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強(qiáng)的曝光時(shí)間和光功率，以檢測鈣信號(hào)，但不要過強(qiáng)，以免對細(xì)胞造成損害。成像的長度將取決于實(shí)驗(yàn)。對于測試激動(dòng)劑或細(xì)胞反應(yīng)，這通常是5-20分鐘的較短成像運(yùn)行，每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，我們會(huì)在18-20小時(shí)內(nèi)成像，每分鐘捕捉一次圖像。

輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細(xì)胞(MA104)的活細(xì)胞成像。MA104細(xì)胞，顯示為綠色，表達(dá)鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在這個(gè)活細(xì)胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細(xì)胞呈紅色——Hyser實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道過，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒導(dǎo)致受感染細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并隨后激活鄰近細(xì)胞中的特定信號(hào)通路，從而引發(fā)未受感染細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的增加(Chang-Graham et al., 2020)

活細(xì)胞成像的技巧

考慮要使用的細(xì)胞系是很重要的。為了研究鈣動(dòng)力學(xué)（或其他細(xì)胞信號(hào)），使用形成單層的細(xì)胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦，以捕捉信號(hào)動(dòng)力學(xué)，從而獲得*佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對于涉及細(xì)胞間通訊和鈣動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞系融合也是一個(gè)重要的考慮因素。為了獲得*佳質(zhì)量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細(xì)胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級塑料載玻片，因此*好測試腔室載玻片。我們的細(xì)胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。

μ-Slide 8 Well high（貨號(hào): 80806）

對于活細(xì)胞成像，重要的是要使細(xì)胞的密度允許形成一個(gè)融合的單層，但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度擁擠和團(tuán)塊。*后一個(gè)技巧是在成像過程中使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實(shí)信號(hào)。因此，重要的是用PBS洗滌細(xì)胞，并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。

Thapsigargin**前后非洲綠猴腎細(xì)胞（MA104）的活體短期成像。MA104細(xì)胞，顯示為綠色，表達(dá)鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色的增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。Thapsigargin是一種眾所周知的肌肉/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑（對從胞質(zhì)溶膠中螯合鈣很重要）。通過這種抑制，Thapsigargin誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并可導(dǎo)致源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加。

參考文獻(xiàn)

Chang-Graham AL, Perry JL, Engevik MA, Engevik KA, Scribano FJ, Gebert JT, Danhof HA, Nelson JC, Kellen JS, Strtak AC, Sastri NP, Estes MK, Britton RA, Versalovic J, Hyser JM. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 2020 Nov 20;370(6519):eabc3621. doi: 10.1126/science.abc3621.