細(xì)胞剪切力實(shí)驗(yàn)--流體剪切力為多功能干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞提供真實(shí)的模擬條件

美國(guó)的科研人員希望能夠通過(guò)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞（iPSC-EC）建立一個(gè)血管發(fā)育的模型。其中，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的剪切力是，血管發(fā)育中不可或缺的條件。流體剪切力能夠使細(xì)胞排列緊密，有規(guī)律。這里以iPSC-EC細(xì)胞為例，使用ibidi Pump System 進(jìn)行一個(gè)流動(dòng)剪切力條件下的細(xì)胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1）細(xì)胞： iPSC-EC            （CDI, Madison,WI）               

2）培養(yǎng)基：VascuLife VEGF Medium（Lifeline Cell Technologies, Frederick, MD）

3）培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I^0.6 Luer （ibidi，Germany，80186）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             封口夾

4）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二、實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)開始前**，請(qǐng)將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一）按照下面流程鋪細(xì)胞：

1）將1×10⁵ cells/cm²密度的細(xì)胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道（圖一）。

2）蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基（圖二）

3）將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)2-4小時(shí)左右，等到細(xì)胞剛剛長(zhǎng)滿為單細(xì)胞層，即可開始實(shí)驗(yàn)（圖三）。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。

                                                           圖三

4）靜置條件下細(xì)胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照。待流體實(shí)驗(yàn)開始的同時(shí)，將靜置細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行72h的培養(yǎng)。注意，培養(yǎng)過(guò)程中每天都要更換培養(yǎng)基。

二）搭建流體系統(tǒng)

1）將灌流管按照說(shuō)明放在置在流體單元上。在灌流管的儲(chǔ)液管中加入12ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會(huì)影響剪切力的大小，有時(shí)還會(huì)使灌流系統(tǒng)中的液體流動(dòng)停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動(dòng)運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）

2）連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細(xì)胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下，放到超凈臺(tái)中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過(guò)滿狀態(tài)(）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。

圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會(huì)有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無(wú)塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測(cè)一下通道內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)。

3）檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲(chǔ)液管液面不會(huì)下降或者上升，那么，整個(gè)系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。

                                        圖五。

4）開始流體剪切力實(shí)驗(yàn)（單向?qū)恿鳎?。將搭建好的流體單元與流體剪切力泵相連后，將整個(gè)流體單元放入二氧化碳培養(yǎng)箱中。打開控制軟件，設(shè)置20 dyn/cm² 培養(yǎng)72h。

三）**熒光實(shí)驗(yàn)

1）去除通道內(nèi)培養(yǎng)基。用1mlPBS沖洗通道，在注入PBS的同時(shí)，用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。

2）加入約200μl的4%多聚甲醛的PBS溶液，用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。靜置10分鐘。

3）按照步驟1）沖洗通道

4）加入200μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

5）按照步驟1）沖洗通道

6）加入200μl 1% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

7）按照步驟1）沖洗通道

8）依次加入一抗，二抗進(jìn)行**熒光染色后，沖洗通道并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察。

三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一）形態(tài)對(duì)比

在培養(yǎng)7天之后，可以直接用顯微鏡觀察到細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，在剪切力刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更加修長(zhǎng)，排列更加緊密和規(guī)律。而靜置狀態(tài)下培養(yǎng)了7天的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有顯著的變化（圖六）。

圖六：如上所示，在20 dyn/cm²刺激下的細(xì)胞更為修長(zhǎng)排列更加緊密。細(xì)胞核；藍(lán)色；綠色：VE- cadherins。